ACC含量的测定

一、目的要求

【资料图】

了解1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）在乙烯生物合成过程中的作用，学习果蔬组织中ACC含量的测定方法。

二、基本原理

ACC可被NaOCl的碱性溶液氧化产生乙烯。乙烯在常温下是气体物质，可直接用气相色谱法测定，然后根据ACC向乙烯转化的效率，就可计算出果蔬组织中ACC的含量。

三、材料、仪器及试剂

（一）材料

梨、苹果、番茄等。

（二）仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、移液器、水浴锅、旋涡混合仪、旋转蒸发仪、样品瓶（20 mL，带有密封橡胶塞）、离心管、试管（25 mL）、气相色谱仪。

（三）试剂

1．95%、80%乙醇溶液

2．25 mmol/L HgCl2溶液

称取67.88 mg HgCl2，用蒸馏水溶解、稀释至10 mL。

3．5% NaClO-饱和NaOH（NaClO: NaOH=2: 1，v/v）混合液

4．1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）

四、实验步骤

（一）ACC的提取与制备

称取5.0 g果蔬样品，置于研钵中，稍加研磨后，转入到试管中，加入10 mL 95%乙醇溶液，煮沸浸提20 min，冷却后于10 000×g离心15 min，收集上清液。再向残渣中加入10 mL 80%乙醇于70 ℃浸提30 min，离心，收集上清液。合并两次浸提液，用旋转蒸发仪在40 ℃条件下将浸提液蒸发至干。向蒸发残留物中加入2.0 mL蒸馏水振荡溶解，即为ACC制备液，于-20 ℃保存备用。

（二）ACC含量的测定

取1.0 mL ACC制备液，置于容积为20 mL的样品瓶中，加入40 µL 25 mmol/L HgCl2溶液，用橡胶塞密封样品瓶，冰浴10 min使温度平衡。再通过注射加入0.2 mL经冰浴预冷的5%NaClO-饱和NaOH（NaClO: NaOH=2: 1，v/v）混合液，迅速振荡5 s后，放回冰浴平衡5 min，顶空取1.0 mL气体，用气相色谱法测定乙烯生成量。

（三）ACC转化率的计算

取同一处理果蔬样品ACC提取液两份，其中一份加入20 µL 0.1 mmol/L ACC标准品作为内标物，按照前面叙述的方法进行测定。两份样品乙烯生成量之差即为所添加的ACC转化为乙烯的量。此外，根据所添加ACC的量，计算出理论上能够形成的乙烯的两，就可以计算出该处理的ACC转化率（R），重复三次。计算公式：

五、实验结果与计算

1．将测定的数据填入下表

2．计算结果

根据气相色谱法测得顶空气体中乙烯含量，计算每克鲜重果蔬样品中ACC的含量，以nmol/g FW表示。计算公式：

式中：

C ——气谱法测得顶空气体中乙烯含量，µl/L；

VL ——样品瓶剩余空间体积，mL；

V ——样品提取液总体积，mL；

R ——ACC向乙烯转变的效率，%；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

W ——样品重量，g；

22.4 ——标准状况下1摩尔气体体积常数，L/mol。

六、注意事项

1．果蔬组织含水量较高，因此在提取ACC时所用的乙醇的浓度较高。

2．某些果蔬果肉组织色素含量很多，需要进行去除色素的操作。可向蒸发残留物中加入1 mL氯仿，振荡2分钟以溶解色素。再加入2.0 mL蒸馏水振荡2 min，于4℃过夜再经8 000 rpm离心10 min分相，弃去氯仿层，水相即为ACC制备液。

3．按照前面的方法测定的是游离的ACC含量。实际上，利用ACC制备液还可测定结合态的ACC（即MACC）含量。取1.0 mL ACC制备液，加入0.2 mL 12 mol/L HCl，于沸水浴中加热3 h。冷却后加入1.2 mL 2 mol/L NaOH中和。然后，按照测定ACC的方法进行测定，即得总的ACC含量。MACC含量为总ACC含量减去游离ACC含量。

4．氯化汞，别名升汞，分子式 HgCl2，分子量 271.52。为无色或白色结晶及颗粒粉末，剧毒。溶于水、醇、醚、丙酮和甲醇，水溶液呈酸性。常温时微量蒸发，遇光逐渐分解生成氯化亚汞。汞离子可使含巯基的酶丧失活性，失去功能，还能与酶分子中的氨基、二巯基、羧基、羟基以及细胞内的磷酰基结合，引起相应的损害，因此要小心使用。